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    質粒DNA純化步驟,您還不知道嗎

    更新時間:2020-12-01      瀏覽次數:1099
       質粒DNA純化步驟,您還不知道嗎
      DNA純化和提取是法醫DNA物證鑒定的關鍵技術之一。質粒是一種小環DNA。在基因工程中,質粒常被用作載體,將靶基因轉移到受體細胞中。雖然近年來發展了許多更*的基因轉移載體(如慢病毒載體、腺病毒載體、AAV載體等),但質粒載體由于其制備簡單、在各種細胞中的高效性,仍被大多數實驗室所使用。
      大量提取的質粒DNA需要進一步純化,常用柱層析法和氯化銫梯度離心法。所有的純化方法通常都使用兩種性質,即相對較小的質粒DNA和共價閉環。例如,用氯化銫進行質粒和染色體DNA的梯度平衡離心,取決于溴化乙錠與線性和閉環DNA分子之間的結合量。
      質粒DNA純化步驟如下:
      1、用無菌牙簽選擇平板上的單個菌落,接種于含有相應抗生素的3ml-LB培養基中,在37℃下于220rpm振動臺上培養過夜。
      2、將1.5mL過夜培養的菌液轉移至Eppendorf離心管內,12000rpm離心30秒,棄上清。
      3、加入100ul預冷的溶液Ⅰ,充分振蕩以懸浮沉淀,冰浴5分鐘。
      4、加入200ul新鮮配制的溶液Ⅱ,輕輕顛倒5次混勻,使溶液澄清,冰浴放置5分鐘。
      5、加入150ul預冷的溶液III,輕微振蕩均勻,冰浴5分鐘。
      6、12000rpm離心10分鐘,轉移上清至另一個滅菌Eppendorf管中。
      7、加入等體積錄仿:異戊醇(體積比24:1),混勻,以12000rpm離心10分鐘,取上層水相至另一個滅菌的Eppendorf試管中。注意,不采用低相溶液。
      8、加入兩倍體積的冰乙醇,混勻,在-20℃沉淀15分鐘,以12000rpm離心10分鐘收集沉淀。
      9、加70%乙醇1ml洗滌一次,12000rpm離心10分鐘,棄去,室溫干燥,加50ul Te溶解核酸,備用。
      好了,以上便是關于質粒DNA純化的相關內容介紹了。
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